比对到hg19和hg38对somatic变异的寻找影响很大

我的bam文件如下：

4.0G Mar 29 06:18 B_marked_fixed.bam
3.8G Mar 29 13:22 D_marked_fixed.bam
4.5G Mar 29 07:26 T_marked_fixed.bam

其中B是正常组织的WES数据，使用varscan找somatic mutation的时候作为normal，然后对另外两个样本（D和T）计算。 从这个bam文件可以看到这个WES测序深度不够高，可能平均就 50X吧，如果是 200X的WES数据的bam应该是有20G左右文件大小。

了解hg19和hg38参考基因组异同

需要知道hg38这个新版参考基因组到底进步在哪里。

首先看somatic mutation个数

统计得到的统计学显著的somatic mutation个数如下：

  278 D_varscan.snp.Somatic.hc
  222 T_varscan.snp.Somatic.hc
  200 d_varscan.snp.Somatic.hc
  174 t_varscan.snp.Somatic.hc

如果只看有可能是somatic mutation个数如下：

  1426 D_varscan.snp.Somatic
  1375 T_varscan.snp.Somatic
  1071 d_varscan.snp.Somatic
  1001 t_varscan.snp.Somatic

其中大写字母的文件代表是比对到了hg19，小写字母的文件是我比对到hg38后跑varscan得到的。可以看到，如果是比对到hg38参考基因组的，那么找到的变异位点要稍微少一点点，不过我意识到参考基因组的有一些是非染色体的片段，所以我重新看了看染色体个数分布情况。

hg38	hg19	chr		hg38	hg19	chr
10	18	1		8	16	1
8	12	2		8	14	2
5	9	3		4	7	3
7	20	4		8	22	4
6	7	5		6	9	5
4	7	6		10	19	6
5	6	7		2	13	7
4	5	8		2	4	8
2	8	9		1	12	9
7	15	10		3	14	10
6	10	11		4	5	11
7	10	12		9	10	12
1	5	13		0	1	13
1	4	14		2	7	14
2	6	15		2	4	15
9	7	16		4	15	16
2	16	17		9	13	17
2	5	18		1	3	18
1	6	19		16	18	19
2	7	20		7	6	20
7	10	21		1	14	21
1	2	22		3	2	22
1	3	X		22	28	X
4	17	Y		4	20	Y
104	215	sum		136	276	sum

左边的是T样本，右边的是D样本，可以看到，换成hg38这个新版人类的参考基因组之后，找到统计学显著的somatic mutation个数显著减少了。

当然了，仅仅是看个数，意义不大，我们需要仔细分析位点。

然后具体到位点

首先可以借用一系列网页工具：

• 用Mutation-Assessor软件来看突变位点对基因或者蛋白功能的影响 比如输入 hg19,13,19447703,C,T 但是一般是看protein-coding基因上面的情况
• snp-nexus 网页略微有点复杂
• 或者把位点当做peaks来注释：http://52.32.26.75:3838/peaks_annotation/
• 可以使用homer来进行注释

其实如果这个位点位于dbSNP数据库，那么接下来一切查询都可以基于rs ID号来进行关联，虽然 rs ID号 也会有些微变化。

因为具体到位点，就涉及到课题组信息了，不便公布，但是思路给大家了，可以是坐标转换，或者以 rs ID号 进行关联比较。最终其实要载入IGV去一对一比较，而且varscan软件给的high confidence的somatic mutation也需要注意，它默认P值卡的是0.05，其实一刀切并不好。

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以上我仅仅是比较了在50X这个测序深度下，VARSCAN软件基于不同参考基因组版本的表现问题。

还可以探索不同的软件，或者不同的测序深度。

我这里只是想说，对配对的WES数据来说，找somatic mutation这件事，值得仔细检查，假阳性问题比较严重。