Kraken2 物种序列比对 注释

kraken基于k-mer精确比对，采用最LCA投票结果快速宏基因组DNA序列进行物种注释。
Kraken2数据库至少包括3个文件

hash.k2d: 物种地图，即所有序列与物种的数据库

opts.k2d: 数据库构建的信息

taxo.k2d: 数据库的分类学信息

以上文件为快速读取，全为二进制文件。
如果仅使用kraken2，除以上三个文件外，其它的文件在空间有限下可以删除。如果要使用bracken时，仍需保留其他文件，用于构建索引等。

标准数据库构建

#下载数据库，先设置存放位置
DBNAME=~/db/kraken2/201127
mkdir -p $DBNAME
#可调线程数据，加速构建过程
kraken2-build --standard --threads 24 --db $DBNAME

标准模式下只下载5种数据库：古菌archaea、细菌bacteria、人类human、载体UniVec_Core、病毒viral

# 下载数据库，先设置存放位置
DBNAME=~/db/kraken2/201201
mkdir -p DBNAME
cd $DBNAME
 
# 下载物种注释，259
kraken2-build --download-taxonomy --threads 24 --db $DBNAME
 
# 下载非默认数据库中的真菌库 1.33G
kraken2-build --download-library fungi --threads 24 --db $DBNAME
 
# 批量下载，非标准数据库
for i in archaea bacteria plasmid viral human fungi plant protozoa nr nt env_nr env_nt UniVec; do
kraken2-build --download-library $i --threads 24 --db $DBNAME
done
 
# 确定的库建索引
kraken2-build --build --threads 24 --db $DBNAME

NCBI上的三个重要的数据库—NR/NT，Taxonomy和RefSeq。NR(Non-Redundant Protein Sequence Database)非冗余蛋白库，所有GenBank+EMBL+DDBJ+PDB中的非冗余蛋白序列，对于所有已知的或可能的编码序列，NR记录中都给出了相应的氨基酸序列（通过已知或可能的读码框推断而来）以及专门蛋白数据库中的***。NR库相当于一个以核酸序列为基础的交叉索引，将核酸数据和蛋白数据联系起来。NT(Nucleotide Sequence Database),核酸序列数据库，是NR库的子集。NCBI的分类数据库，包括大于7万余个物种的名字和种系，这些物种都至少在遗传数据库中有一条核酸或蛋白序列。其目的是为序列数据库建立一个一致的种系发生分类学。RefSeq(the reference sequence database,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ ).参考序列数据库，包含RefSeq_genomic(NCBI genomic reference sequences)，RefSeq_protein(NCBI protein reference sequences)和RefSeq transpans(NCBI transpans reference sequences)具有生物意义上的非冗余基因,转录本和蛋白质序列，是经过NCBI和其他组织校正的数据库，使用人类基因命名委员会定义的术语，并且包括了官方的基因符号和可选的符号。[3]

自行添加基因组，需要满足以下两点要求

fasta格式，可以多个文件

必须包括NCBI物种ID，如>sequence16|kraken:taxid|32630 Adapter sequence

# 添加单个序列
kraken2-build --add-to-library chr1.fa --db $DBNAME
 
# 批量添加序列
for file in chr*.fa
do
    kraken2-build --add-to-library $file --db $DBNAME
done

数据库确定后，建索引

kraken2-build --build --db $DBNAME
—kmer-len 和 minimizer-len，要求核酸至少31，蛋白至少15

kraken2-build —help查看更多参数

非NCBI数据库

支持核酸数据库Greengene、RDP、SILVA数据库制作。它们的物种注释不遵循NCBI的Taxonomy标准。

Greengenes (greengenes), 所有可用的16S

RDP (rdp), 细菌和古菌16S

SILVA (silva), 核糖体小亚基99%非冗余NR99序列集

以里以SILVA为例，因为它不仅包括16S，还包括18S，更适合宏基因组数据

kraken2-build --db $DBNAME --special silva