无参转录组做没有参考基因组的SNP calling（Kissplice）

几个重要的网站：
kissplice:http://kissplice.prabi.fr/
在线blat：http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat
SNP calling from RNA-seq data without a reference genome: https://academic.oup.com/nar/article/44/19/e148/2468394
TransDecoder使用的简易教程：https://www.bioinfo-scrounger.com/archives/106/

1. 安装：建议在conda中安装

   blatsuit：解压就可以用，blat加命令直接调用

   wget http://hgwdev.cse.ucsc.edu/~kent/exe/linux/blatSuite.36.zip
   ./blat
   

   kissplice2refgenome-2.0.0：按照说明书安装

   wget ftp://pbil.univ-lyon1.fr/pub/logiciel/kissplice/tools/kissplice2refgenome-2.0.0.tar.gz
   tar xvzf kissplice2refgenome-1.0.0.tar.gz 
   cd  kissplice2refgenome-1.0.0
   python setup.py install --user
   kissplice2refgenome -h
   

   kissplice2reftranscriptome-1.3.3：按照说明书安装

   wget ftp://pbil.univ-lyon1.fr/pub/logiciel/kissplice/tools/kissplice2reftranscriptome-1.3.3.tar.gz
   tar zxvf kissplice2reftranscriptome.tar.gz
   cd kissplice2reftranscriptome
   python setup.py install --user 
   kissplice2reftranscriptome -h 
   

   kissplice-2.5.3：解压直接调用.py程序（Wrong！！！各种出错）

   wget ftp://pbil.univ-lyon1.fr/pub/logiciel/kissplice/download/kissplice-2.5.3.tar.gz
   

   鄙人debug了一下午，终于发现kissplice只能够通过conda先装2.7再装kissplice再更新kissplice才可以完整跑过。

   conda install -c bioconda python=2
   conda install -c bioconda kissplice
   

2. 下载说明书

   2.1 wget ftp://pbil.univ-lyon1.fr/pub/logiciel/kissplice/tools/kissplice2refgenome_userguide_1.2.0.pdf

   2.2 wget ftp://pbil.univ-lyon1.fr/pub/logiciel/kissplice/tools/kissplice2reftranscriptome_userguide.pdf

3. 整理居群材料

   A：对囊厥属 Deparia 个体数：5 编号：RS144、RS150、RS174、RS216、RS227

   B：蹄盖蕨属 Athyrium 个体数：4 编号：RS247、RS255、RS276、URCP

   蹄盖蕨科 （对囊厥属+蹄盖蕨属+ 双盖蕨属 +其他） 个体数5+4+7 编号：RS14、RS169、RS170、RS224、Diplazium (RS262、RS193、UFJN )

   B：乌毛蕨科 Woodwardia/Struthiopteris/Stenochlaena 个体数：6 编号：RS166、RS168、RS178、RS223、RS128、RS97

   A：岩蕨科 Protowoodsia/Woodsia 个体数：3 编号：RS229、RS103、YJJY

   所需数据：组装好的fa文件，质控好的fa双端文件

4. 运行kissplice

   #sample
   kissplice -r sample_example/virus2.fq -r sample_example/virus1.fq -r sample_example/mock1.fq -r  sample_example/mock2.fq
   #real
   

5. 运行trinity，组装转录组

   trinity --seqType fq --left reads_1.fq --right reads_2.fq --CPU 6 --max_memory 20G
   

6. 运行BLAT（原理与blast差不多，就是将kissplice预测出来的SNP位点map到trinity组装好的转录组上，对于我而言，我将一个属当做一个居群，所以一个种BLAT一次，每个样BLAT用的kissplice文件相同，转录组文件不同）

/home/chenss/packages/blatsuite/blat --minIdentity=80 Trinity.fasta kissplice_output_type0_coherent.fa output.psl 

做到这里就已经做完SNP Calling 了，如果不做Function就不用往下了。

7. TransDecoder寻找ORF

conda install -c bioconda TransDecoder
TransDecoder.LongOrfs -t Trinity.fasta
/home/chenss/packages/TransDecoder-master/TransDecoder.LongOrfs -t Trinity.fasta

8. 运行kissplice2reftranscriptome

Usage: kissplice2reftranscriptome [-h]
      -b PATH_TO_TRINITY_FILE
      -k PATH_TO_KISSPLICE_FILE
      -t PATH_TO_BLAT_FILE
      [-s PATH_TO_KissDE_FILE]
      [-o PATH_TO_MAIN_OUTPUT_FILE]
      [-l PATH_TO_LOW_QUERY_COVERAGE_OUTPUT_FILE]
      [-m PATH_TO_MERGED_BUBBLES_OUTPUT_FILE]
      [-u PATH_TO_UNTREATED_BUBBLES_OUTPUT_FILE]
      [-Q QC_MIN] [-C KC_MIN] [-K K_VAL]
      [--merge_codon] 

ORF需要输入bed格式所以先利用transdecoder进行格式转换：gff3 - bed

conda install -c bioconda transdecoder
#先利用gff3_file_to_bed.pl 寻找位置
/home/chenss/miniconda3/envs/py/bin/gff3_file_to_bed.pl longest_orfs.gff3 > longest_orfs.bed
#可以打开看看bed文件，去除不必要的注释信息防止以后报错

kissplice2reftranscriptome \
-b ./RS247A.Trinity.fa.transdecoder_dir/longest_orfs.bed \
-k ./results/results_RS247A_RS255A_RS276_k41_coherents_type_0a.fa \
-t ./output.psl \
-o reftrans.tsv