欢迎您访问程序员文章站本站旨在为大家提供分享程序员计算机编程知识!
您现在的位置是: 首页

使用BRAKER2进行基因组注释(v 2.1.5版)

程序员文章站 2024-03-02 00:02:16
...

BRAKER2是一个基因组注释流程,能够组合GeneMark,AUGUSTUS和转录组数据。

在使用软件之前,有几点需要注意下

  • 尽量提供高质量的基因组。目前随着三代测序价格下降,这一点问题不大。
  • 基因组命名应该简单,最好就是">contig1"或">tig000001"
  • 基因组需要屏蔽重复序列
  • 默认参数通常表现效果就很好,但是也要根据物种来
  • 一定要对注释结果进行检查,别直接使用

软件安装

BRAKER的依赖软件不少,且Perl需要安装的模块也很多,但是我们可以直接用bioconda进行安装

conda create -n braker2 braker2=2.1.5

使用conda安装结束后会有一些提示语,总结如下

  • 保证AUGUSTUS的config目录能够有可写权限(自己用conda安装不需要考虑这个问题)
  • GeneMark/GenomeThreader/ProtHint需要额外下载安装

尽管可以使用容器化技术,但是由于软件运行时需要对AUGUSTUS里的配置文件进行读写,需要额外设置,因此不在此介绍

由于部分软件的版权限制,也就是GeneMakr, GenomeThreader, ProHint,我们还需要手动安装这些软件。但其中只有GeneMark是必须的,因为我们更多是利用RNA-seq数据进行模型训练,而GenomeThreader, ProHint是利用同源蛋白进行注释才用到,其中GenomeTrheads是处理近源蛋白,而ProHint是处理未知距离的蛋白。

http://exon.gatech.edu/GeneMark/license_download.cgi 下载GeneMark,并按照文档进行安装,最后添加环境变量

export GENEMARK_PATH=/your_path_to_GeneMark-ET/gmes_petap/
#例如,我的安装路径为/opt/biosoft/gm_et_linux_64
export GENEMARK_PATH=/opt/biosoft/gm_et_linux_64

安装完成之后,建议运行下面这一步检查软件依赖

braker.pl --checkSoftware

软件运行

BRAKER根据数据类型,有不同的运行模式,但根据现状其实最常见的情况是测了一个基因组,并且还测了二代的转录组。因此假设你手头有下面这些数据

  • 基因组序列: genome.fasta
  • 转录组数据: XX_R1.fq.gz, XX_R2.fq.gz, YY_R1.fq.gz, YY_R2.fq.gz, ZZ_R1.fq.gz, ZZ_R2.fq.gz

第一步: 屏蔽基因组中的重复序列,这一步参考使用RepeatModeler和RepeatMasker注释基因组重复序列

RepeatMasker -xsmall -species arabidopsis -pa 40 -e ncbi  -dir . genome.fasta
#-xsmall: soft-mask

这一步输出的genome.fasta.masked将是后续注释的输入

第二步: 使用STAR将FastQ比对到参考基因组,STAR使用说明参考「RNA-seq分析软件」RNA-seq比对工具STAR学习笔记

mkdir -p STAR
# 建立索引
STAR \
    --runThreadN 20 \
    --runMode genomeGenerate \
    --genomeDir STAR \
    --genomeFastaFiles genome.fasta
# 比对
STAR \
    --genomeDir STAR \
    --runThreadN 20 \
    --readFilesIn XX_R1.fq.gz, XX_R2.fq.gz \
    --readFilesCommand zcat \
    --outFileNamePrefix xx_ \
    --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
    --outBAMsortingThreadN 10 \
    --outSAMstrandField intronMotif \
    --outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonical
mv xx_Aligned.sortedByCoord.out.bam xx.bam

输入结果为 xx.bam 如果测了多个组装的转录组,为每个样本运行一次比对生成多个BAM文件。

第三步: 运行BRAKER2。--cores 40表示使用40个线程, --softmaksing表示输入序列是软屏蔽。

braker.pl --cores 40 --species=yourSpecies --genome=genome.fasta.masked \
     --softmasking --bam=xx.bam,yy.bam,zz.bam \
     --gff3

这里xx.bam, yy.bam,zz.bam指的是不同组织的BAM文件,需要根据实际情况进行修改。

对于链特异性转录组测序结果,需要将BAM文件拆分成正链和负链两个bam,然后设置--stranded参数。

braker.pl --species=yourSpecies --genome=genome.fasta.masked \
   --softmasking --bam=plus.bam,minus.bam,unstranded.bam \
   --stranded=+,-,. --UTR=on

如果需要使用近源序列作为输入(protein.fa),需要加上--prot_seq--prg参数,速度会慢一些

braker.pl --cores 40 --species=yourSpecies --genome=genome.fasta.masked \
     --softmasking --bam=xx.bam,yy.bam,zz.bam \
     --gff3 \
     --prot_seq=proteins.fa --prg=exonerate \

个人感觉,只要转录组测得够,不需要考虑同源蛋白数据。

最终会输出蛋白序列和CDS序列以及GFF文件

  • augustus.hints.gtf: 在--esmode时不会出现
  • augustus.hints_utr.gtf: 在设置--UTR=on时生成
  • augustus.ab_initio.gtf: 在设置--AUGUSTUS_ab_initio生成
  • augustus.ab_initio_utr.gtf: 在从头预测的基础上设置--UTR=pn时生成
  • GeneMark-E*/genemark.gtf: GeneMark的注释结果
  • braker.gtf: AUGUSTUS或GeneMark预测的所有结果
  • hintsfile.gff: 来自于RNA-seq/蛋白数据的外部证据信息

此外,如果没有设置--skipGetAnnoFromFasta, 还会有augustus.hints.aaaugustus.hints.codingseq

注意: BRAKER没有断点重跑功能,因此如果中途运行中断,重新运行之前的命令并不会断点重跑,反而会因为同样的参数和之前运行在AUGUSTUS的config/species生成的目录冲突而中断。另外设置--useexisting只是覆盖之前config/species对应的目录,而不是利用已有的文件重新开始

尽管如此,我们还是能够在BRAKER中通过跳过一些步骤来避免一些重复运算

  • --skipGeneMark-ES/--skipGeneMark-ET/--skipGeneMark-EP/--skipGeneMark-ETP: 跳过GeneMark训练这一步,使用之前的结果braker/GeneMark-ET/genemark.gtf,或者使用--geneMarkGtf设置GTF文件
  • --skipAllTraining: 跳过GeneMark和AUGUSTUS的模型训练,使用之前的参数和文件(--useexisting)运行AUGUSTUS

官方教程也提供了一些案例,见https://github.com/Gaius-Augustus/BRAKER#starting-braker-on-the-basis-of-previously-existing-braker-runs

除此之外,如果想要提高速度,还可以设置如下参数

  • --skipOptimize: 跳过参数优化步骤(不推荐)
  • --rounds: 参数优化迭代数,默认是5,追求速度可以设置的低一些

可能问题

运行时出现和OpenBLAS相关的警告和报错

OpenBLAS blas_thread_init: RLIMIT_NPROC 4096
OpenBLAS blas_thread_init: pthread_create failed for thread 26 of 128: Resource temporarily unavailable

需要在运行前设置如下两个环境变量

export OMP_NUM_THREADS=1 #限制CPU数
export USE_SIMPLE_THREADED_LEVEL3=1

使用conda安装时可能会出现的问题

Error in file bamToWig.py at line 172: Return code of subprocess was 127

原因是因为faToTwoBit程序出错

faToTwoBit
faToTwoBit: error while loading shared libraries: libssl.so.1.0.0: cannot open shared object file: No such file or directory

这是因为conda没能正确处理依赖关系,openssl版本过高,解决方法如下

# 建立软链接
cd ~/miniconda3/envs/braker2/lib
ln -s libssl.so libssl.so.1.0.0
ln -s libcrypto.so libcrypto.so.1.0.0

参考资料