转录组入门3：了解fastq测序数据（补遗）

fastqc 检测测序文件质量
创建一个文件夹

mkdir fastqc/

创建一个fastqc.sh脚本
-o: 输出路径
-t: 线程数，和电脑配置有关，每个线程需要250MB 的内存

质量解读
html 格式用浏览器打开

基本信息
Enconding: 测序平台版本号
Total Sequence: reads 的数量
Sequence length: 总的序列数
%GC GC比，这个指标有物种意义，用于区别物种，一般人类42%

每个read各位置碱基的测序质量
横轴碱基的位置（1-51），纵轴是质量分数，20表示1%的错误率，30表示0.1%
红色线代表中位数，蓝色代表平均数，黄色是25%-75%区间，触须是10%-90%区间
Warning 报警 如果任何碱基质量低于10,或者是任何中位数低于25
Failure 报错 如果任何碱基质量低于5,或者是任何中位数低于20
偏离度
横轴碱基的位置（1-51） - 纵轴是tail的Index编号 - 检查reads中每一个碱基位置在不同的测序小孔之间的偏离度，蓝色代表偏离度小，质量好，越红代表偏离度越大，质量越差。 - 这个图主要是为了防止，在测序过程中，某些tail受到不可控因素的影响而出现测序质量偏低

reads质量的分布
横轴表示Q值，0-40
纵轴是每个值对应的reads数目
当峰值小于27时，警告；当峰值小于20时，fail。我的报告峰值在38

GC 含量统计
横轴碱基的位置（1-51） - 纵轴是碱基含量百分比 - 图中四条线代表A T C G在每个位置平均含量 - 当部分位置碱基的比例出现bias时，即四条线在某些位置纷乱交织，往往提示我们有overrepresented sequence的污染。 - 本结果前10个位置，每种碱基频率有明显的差别，说明有污染。 - 当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%，报"WARN"；当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%，报"FAIL"

序列平均GC含量分布图
横轴是百分比； 纵轴是每条序列GC含量对应的数量。蓝色的线是程序根据经验分布给出的理论值，红色是真实值，两个应该比较接近才比较好 - 当红色的线出现双峰，基本肯定是混入了其他物种的DNA序列 - 偏离理论分布的reads超过15%时，报"WARN"；偏离理论分布的reads超过30%时，报"FAIL"

各位置N的reads比率
当测序仪器不能辨别某条reads的某个位置到底是什么碱基时，就会产生“N”，统计N的比率 - 正常情况下，N值非常小 - 当任意位置的N的比例超过5%，报"WARN"；当任意位置的N的比例超过20%，报"FAIL"

reads 长度分布
每次测序仪测出来的长度在理论上应该是完全相等的
当reads长度不一致时报"WARN"；当有长度为0的read时报“FAIL”
当测序的长度不同时，如果很严重，则表明测序仪在此次测序过程中产生的数据不可信

统计不同拷贝数的reads的频率
横坐标是duplication的次数，纵坐标是duplicated reads的数目,以unique reads的总数作为100% - 测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication，这是正常的现象，但如果duplication的程度很高，就提示我们可能有bias的存在
当非unique的reads占总数的比例大于20%时，报"WARN"；当非unique的reads占总数的比例大于50%时，报"FAIL"

接头含量
此图衡量的是序列中两端adapter的情况 - 如果在当时fastqc分析的时候-a选项没有内容，则默认使用图例中的四种通用adapter序列进行统计 - 本例中adapter都已经去除，如果有adapter序列没有去除干净的情况，在后续分析的时候需要先使用cutadapt软件进行去接头

重复短序列
这个图统计的是，在序列中某些特征的短序列重复出现的次数
我们可以看到1-8bp的时候图例中的几种短序列都出现了非常多的次数，一般来说，出现这种情况，要么是adapter没有去除干净，而又没有使用-a参数；要么就是序列本身可能重复度比较高，如建库PCR的时候出现了bias
对于这种情况，我的办法是可以cut掉前面的一些长度，可以试着cut 1bp