荧光素(FITC)标记亲和素(FITC-Avidin)操作步骤

和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。
荧光素(FITC)标记亲和素(FITC-Avidin)操作步骤：

（一）获得目的基因

1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达载体

1、荧光素(FITC)标记亲和素(FITC-Avidin)载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

（三） 获得含重组表达质粒的表达菌种

1、 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3、 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

（四）诱导表达

1、荧光素(FITC)标记亲和素(FITC-Avidin)挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml
LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。
2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml
培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（*0.6，大约需3hr）。
3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM
作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。
4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀，用100μl 1%SDS重悬，混
匀,70℃10min。
5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。